正在試運行中
AFADESI-MSI是一種新型的常壓敞開式離子化技術，無需放射性同位素或熒光標記，通過與高分辨質譜儀聯機使用，可直觀反映目標分子或者未知化合物分子在生物體內的原位代謝信息，能夠解決具有空間分布差異或者結構差異相關的生物學問題。該技術借助于高速的空氣流，實現了離子的遠距離傳輸，擴展了待測樣品的檢測空間和靈活性，靈敏度可達pg級別，動態范圍達到三個數量級，覆蓋1500個化合物，如膽堿類、多胺類、氨基酸類、肉堿類、核苷類、核苷酸類、有機酸類、碳水化合物類、膽固醇類、膽酸類、脂質類等多種類代謝物。
中國醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室再帕爾·阿不力孜、賀玖明團隊在分析化學一區《Analytical Chemistry》期刊發表封面文章，題為“Mapping Metabolic Networks in the Brain by Ambient Mass Spectrometry Imaging and Metabolomics”的研究成果，采用自主研發的AFADESI-MSI技術，建立了一種高靈敏空間代謝組學方法，實現了大鼠腦組織中多種類極性內源性代謝物的高覆蓋成像，結合代謝通路分析，全面繪制腦代謝網絡圖譜，揭示了東莨菪堿致大鼠記憶功能障礙模型的代謝改變及其腦微區分布特征。（文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00467）
大腦功能與其復雜的微區結構密切相關。研究腦中分子變化有助于理解中樞神經系統疾病的發病機制，推動藥物研發。質譜成像(MSI)技術具有高靈敏、方便、省時以及免標記的優勢，已成為繪制蛋白質、代謝產物和脂質圖譜的強大工具，但高通量成像表征腦中的極性小分子代謝物仍具挑戰。本文對課題組研發的空氣動力輔助離子化質譜成像（AFADESI-MSI）平臺進行了優化，應用空間分辨代謝組學繪制了大鼠腦代謝網絡。
SD大鼠腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿（給藥組、對照組各3只），安樂死后取出大腦，用冷凍切片機制成20 μm厚的矢狀切片，相鄰的大腦切片進行H&E和Nissl染色。
SD大鼠腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿（給藥組、對照組各3只），安樂死后取出大腦，用冷凍切片機制成20 μm厚的矢狀切片，相鄰的大腦切片進行H&E和Nissl染色。
原始數據轉換后應用MassImager軟件進行可視化。將光學圖像精準匹配感興趣區域的離子強度，獲取差異代謝物信息。通過在線數據挖掘工具Metaboanalyst完成了代謝物的高通量注釋。Cyctoscape用于可視化大腦中的復雜網絡。
兩組大腦樣本選擇相同的微區進行組織學特征性離子圖像疊加，采用t檢驗(n = 3)進一步驗證數據處理結果。
研究通過優化實驗確定ACN / H2O（8:2）作為理想的噴霧溶劑。圖像中小腦小葉間隔（約為78.0 μm）清晰可見，表明AFADESI-MSI的實際空間分辨率小于100 μm。此外，成像結果顯示質量差為30ppm的兩種代謝物可以得到明顯分離，檢測的動態范圍高達1000倍。如圖所示，通過AFADESI-MSI獲得的一些具有代表性的代謝物，離子強度從0~106，其分布特征與腦功能結構高度一致。
圖1. AFADESI-MSI和代謝組學繪制大鼠大腦代謝網絡的策略，以及代表性極性內源性代謝物離子圖像。
實驗通過AFADESI-MSI在正負離子模式下獲得了298和372個特征離子圖像。包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、脂肪酸和神經遞質（NTs）等。結果顯示γ-氨基丁酸（GABA）在中腦、嗅球和下丘腦中信號強度較高；多巴胺（DA）主要集中分布在紋狀體；組胺（HA）作為一種興奮性NTs集中在丘腦和下丘腦中。松果體在睡眠和光周期調節方面起著重要的作用，由于其體積小容易被忽視。實驗在該區域檢測到共106種極性代謝物，發現吲哚乙醛、吲哚、5'-甲基硫代腺苷和褪黑素高表達，且褪黑素上游代謝產物血清素(5-HT)在松果體中也有特定的分布。
圖2.AFADESI-MSI和MetaboAnalyst獲得的大鼠腦中的代謝網絡。
研究將光學圖像和MSI圖像進行精確疊加，從大腦微區中提取代謝圖譜進行代謝網絡重構。圖中顯示了包括谷氨酸代謝、花生四烯酸代謝、葡萄糖代謝、嘌呤代謝、三羧酸循環等在內的代謝途徑。這些信息有助于在系統水平上深入了解大腦的代謝活動。如圖3A所示，嘌呤代謝中，AMP和GMP在大腦皮層和松果體中高表達，但在胼胝體和穹隆中強度較弱。這些結果表明，代謝物的分布在大腦中表現出功能區域特異性。
圖3.AFADESI-MSI獲得大鼠腦內嘌呤代謝途徑及相關代謝產物分布(A)和AMP在大鼠腦各層的分布(B)。
如圖展示了NTs及其相關代謝物在大鼠腦內的分布特征和聯系。結果表明代謝物在腦微區結構中的代謝速度是可變的，并定義了區域內穩態的條件。如組氨酸作為組胺（HA）的前體在松果體中分布稍高，而HA僅在丘腦和下丘腦中觀察到；HA代謝下游產物甲基組胺在丘腦和下丘腦中的分布比HA更廣泛，從而進一步證明了代謝網絡的區域多樣性和復雜性。
圖4.(A)神經遞質及其相關代謝物在大鼠腦中的分布;(B)神經遞質調節和代謝網絡。
研究應用AFADESI-MSI分析了對照組和東莨菪堿治療的大鼠腦矢狀切片。顯示了差異代謝物在不同腦微區的含量，如N-甲酰犬尿氨酸、L-色氨酸和5-HTP這三種代謝物同屬于色氨酸代謝通路，表明東莨菪堿擾亂了腦區色氨酸代謝過程或相關代謝物的區域間轉運。此外，NTs調節網絡也受到了干擾，腦導管內HA和甲基組胺升高， GABA、Glu、谷胱甘肽也發生變化。對給藥組大腦的10個微區進行了分析，結果在腦橋中發現16個異常代謝物，而在大腦皮質中發現7個異常代謝物，表明腦橋和大腦皮質可能是對東莨菪堿作用最敏感的區域。
圖5.東莨菪堿模型大腦中代謝網絡改變。
如下圖所示，顯示了其中幾種異常表達的代謝產物的分布，如腺嘌呤在小腦皮層發生顯著下調;HA在腦導水管下調 (圖6A-H)。這些代謝物的相對定量信息進一步表明，藥物效應在大腦中具有多樣性和區域特異性。基于空間分辨的代謝組學為發現酶或基因異常提供了線索，但要完成完整的代謝網絡分析需要在蛋白質和基因水平上進一步驗證。
圖6.東莨菪堿治療大鼠學習記憶障礙腦模型的AFADESI-MSI圖像和代謝物統計結果(n = 3)。
本研究開發了一種針對極性內源性代謝小分子高靈敏、高覆蓋的分子成像方法，通過AFADESI-MSI空間代謝組學分析，全面繪制了腦代謝網絡及其空間分布，無需衍生化和復雜的前處理，實現了對NTs、核苷酸代謝物、多胺、肌酸等極性分子的可視化，為腦中生理、病理和藥理過程的機制、功能、以及神經系統中各區域間的相互聯系提供了線索和代謝網絡調控研究的新視角。本文運用該方法進一步研究了東莨菪堿模型腦的微區代謝變化，結合統計分析，揭示了與記憶功能障礙直接相關的代謝通路顯著改變及其微區分布特征。
數據來源：“質譜成像”微信公眾號
中國醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室再帕爾·阿不力孜、賀玖明團隊在《PNAS》上發表了一篇題為“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的研究論文，采用AFADESI-MSI技術，建立了空間分辨的原位代謝組學方法，并提出一種“下游代謝物與上游代謝酶關聯” 的研究策略來表征腫瘤代謝改變；結合免疫組化分析驗證，從代謝物和代謝酶兩個層次和組織原位深入探究食管癌的代謝改變，發現并可視化表征了食管癌異常的代謝通路及其代謝酶。（文章鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.1808950116）
獨特的代謝模式是腫瘤細胞區別于正常細胞的重要特征，越來越多的研究表明，在腫瘤的發生、發展過程中，腫瘤細胞會發生特定譜式的代謝改變以適應腫瘤生長。對于不同組織來源的腫瘤細胞，盡管彼此間的基因變異譜千差萬別，但是，幾乎所有的腫瘤都需要通過類似的代謝重編程（Metabolic Reprogramming）來維持其無限制的細胞增殖。腫瘤代謝的表征能夠為癌癥病理機制研究、腫瘤診療新指標和干預靶點的發現提供新的契機。然而，到目前為止，如何全面的發現腫瘤的異常代謝，尤其是如何從代謝物和代謝酶兩個層面上原位地表征腫瘤的異常代謝仍然面臨非常大的困難。
收集256例人鱗片狀食管癌（ESCC）組織標本，包括癌組織、癌旁組織和遠端非癌組織，制成冰凍組織切片。如圖1所示，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化質譜成像技術（AFADESI-MSI），采集上述組織中內源性代謝物及其空間分布信息；對相鄰切片進行HE染色；采用MassImager質譜成像數據處理軟件，使質譜成像圖與HE染色圖匹配重合，按不同組織類型及空間分布提取代謝物輪廓信息；使用SIMCA軟件進行多變量統計分析，篩選出與腫瘤代謝相關的差異代謝物；根據差異代謝物及其鑒定結果富集分析發生變化的代謝通路及推測關鍵代謝酶；采用免疫組化方法檢測鎖定的代謝酶表達，進一步驗證其與代謝標志物是否具有同樣的空間分布特征。
脯氨酸作為細胞微環境中的重要氨基酸參與細胞凋亡和自噬，在癌癥代謝中的重要作用得到越來越多的關注。根據256個食管癌組織樣本的統計數據，癌區脯氨酸離子強度顯著高于上皮和肌肉區(P<0.001，圖2C)。采用免疫組化方法檢測與脯氨酸合成相關的關鍵代謝酶吡咯-5-羧酸還原酶2（PYCR2）在ESCC組織切片中的空間表達，發現PYCR2只在癌區表達(圖2e)，與食管癌組織中脯氨酸的空間分布一致。
圖2 脯氨酸生物合成途徑中關鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A）脯氨酸的質譜成像（B）光學-MSI重疊圖像（C）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中脯氨酸水平 ***p<0.001（D）ESCC組織的HE染色圖 （E）不同ESCC組織中PYCR2的表達 CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
尿苷是RNA合成的重要核苷前體，也參與嘌呤核苷酸生物合成和碳水化合物代謝。此外，組織中尿苷的水平對于嘧啶類抗代謝藥物的抗腫瘤治療至關重要。研究發現癌組織中尿苷含量高于上皮組織而低于肌肉組織（P<0.001,圖3 A1和A3），而尿嘧啶的含量在癌組織中顯著升高（P<0.001,圖3 A2和A4），尿嘧啶/尿苷離子強度比（圖3A6）在癌區顯著增加，可以作為區分癌組織與癌旁正常組織的生物標志物。同樣，免疫組化結果顯示催化尿嘧啶生成尿苷的代謝酶尿苷磷酸化酶1(UPase 1)在癌組織中的表達上調。
圖3A 尿苷代謝途徑中關鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A1，A2）尿苷和尿嘧啶的質譜成像圖 （A3，A4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶水平 ***p<0.001（A5）UPase 1介導的尿苷轉換為尿嘧啶的代謝過程（A6）根據尿嘧啶/尿苷離子強度比值構建的質譜成像圖 （A7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶的強度變化（A8）ESCC不同區域UPase 1的表達 CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
組氨酸在組氨酸脫羧酶(HDC)的介導下代謝為組胺。有越來越多的證據顯示組胺直接參與致癌作用，可以作為一種潛在的細胞保護劑來改善癌癥治療。根據一些研究者的說法，基于組胺的治療能促進癌細胞中DNA損傷、凋亡和衰老并可以顯著增加患癌動物的存活率。在本研究中，組氨酸和組胺呈現完全相反的空間分布。根據256例食管癌組織樣本的成像數據，組氨酸在癌組織中顯著上調而組胺顯著下調。組胺與組氨酸的離子強度差異如圖3B7所示。通過計算組胺與組氨酸的離子強度比，對HDC介導的組氨酸脫羧反應進行了研究(3B6)，發現腫瘤組織的脫羧率相對于肌肉和上皮組織較弱。和基于強度比的質譜成像預測的一致，腫瘤組織的HDC表達水平低于肌肉組織和上皮組織。
圖3B 組胺代謝途徑中關鍵代謝物和代謝酶的原位分析 （B1，B2）組氨酸和組胺質譜成像圖（B3，B4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺水平 （B5）HDC介導的組氨酸轉換為組胺的代謝過程（B6）根據組胺/組氨酸離子強度比值構建的質譜成像圖（B7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺的離子強度變化（B8）ESCC不同區域HDC的表達。此外，發生改變的代謝途徑還有谷氨酸代謝，脂肪酸合成以及多胺的生物合成，均在腫瘤組織中表現為顯著增多，相應的免疫組化結果也證明與上述途徑有關的關鍵代謝酶在癌區的表達也明顯上調。以下（表1）為通過256例食管癌患者組織樣本篩選出的發生改變的6條代謝途徑和相應的關鍵代謝酶：
表1 篩選出癌癥相關的代謝產物、代謝酶、代謝途徑
該研究建立了一種高靈敏的空間分辨的原位代謝組學方法，對食管癌潛在原位標志物進行了代謝通路分析，并對通路上相關聯代謝物的分布特征進行原位可視化表征，分析其空間變化趨勢，發現了并驗證了6個在食管癌中異常表達的代謝酶：吡咯-5-羧酸還原酶2(PYCR2)、谷氨酰胺酶(GLS)、尿苷磷酸化酶1(UPase1)、組氨酸脫羧酶(HDC)、脂肪酸合成酶(FASN)和鳥氨酸脫羧酶(ODC)，它們廣泛參與食管癌相關的腫瘤代謝過程，其中PYCR2和UPase1被首次發現在食管癌中異常改變。研究結果表明脯氨酸生物合成，谷氨酸代謝，尿苷代謝，組氨酸代謝，脂肪酸合成，多胺生物合成等代謝通路在食管癌組織中發生了顯著變化。這些癌癥代謝相關信息有助于增加對癌癥代謝重編程的理解。基于AFADESI-MSI技術的空間分辨原位代謝組學方法，不僅可驗證腫瘤原位標志物的可靠性；同時針對腫瘤等具有復雜結構的組織，它具有原位、無需特殊標記、無需復雜耗時的前處理及反復染色過程，能夠高通量地發現腫瘤異常變化的代謝通路及其代謝酶等優勢；可從代謝物和代謝酶兩個層次全面表征腫瘤的代謝改變并發現其潛在功能，為深入探究腫瘤的代謝改變提供了全新的研究視角。
數據來源：“質譜成像”微信公眾號
中國醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室再帕爾·阿不力孜、賀玖明團隊在《Theranostics》上發表了一篇題為“Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging”的研究論文，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化（AFADESI）技術和基于人工神經網絡（ANN）的虛擬校正-定量質譜成像（VC-QMSI）方法，建立了針對紫杉醇及其衍生物前藥的體內定量成像方法，為評估該類藥物的腫瘤靶向效率和瘤內異質性分布提供了直觀有效的途徑，也為靶向抗腫瘤新藥研發提供了有力的研究工具。（文章鏈接：doi: 10.7150/thno.41763. eCollection 2020.）
可區分正常組織和腫瘤組織的靶向抗腫瘤藥物開發是癌癥治療研究中的關鍵問題。在新藥研發的早期，如何快速評估抗癌藥物的腫瘤靶向性非常重要，且了解藥物在腫瘤內的異質性分布更具挑戰。開發一種高精度、高靈敏度的定量成像分析方法有望解決這一難題。質譜成像是一種無需標記的分子成像技術，它可提供有關生物體內藥物和代謝物分布的時空信息，其在藥物開發領域的應用正在迅速增加。紫杉醇具有很強的抗腫瘤活性，但直接用藥常伴隨有骨髓抑制、神經毒性等嚴重不良反應；近年來臨床致力于對紫杉醇進行結構優化、劑型改造或前體藥物開發，以提高藥物的腫瘤靶向能力，減少副作用。本研究建立了紫杉醇及其衍生物前藥的體內定量成像方法，評估了該類藥物的腫瘤靶向效率和瘤內異質性分布。
通過構建含已知濃度藥物的模擬生物組織，建立了定量質譜成像標準曲線；采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化質譜成像（AFADESI-MSI）技術，同時采集藥物、藥物代謝物和內源性代謝物信息；以內源性代謝物為內標，結合ANN方法，構建了生物組織中質譜響應基體效應自動預測與校正的回歸模型，對動物切片的單位像素進行逐一定量，從而建立了整體動物體內藥物質譜成像分析方法。將該方法用于評估靜脈注射紫杉醇（PTX）、紫杉醇脂質體（PTX-liposome）和紫杉醇前藥（PTX-R）在A549細胞異種移植裸鼠中的靶向效率和瘤內的分布異質性。
該策略的步驟如下：采用含有相同藥量的不同類型的模擬組織，篩選出與藥物響應強度變化緊密相關的內源性代謝物，并建立藥物的相對響應強度（相對校正因子RCF）與內源性代謝物離子強度之間的ANN模型（圖1A）。根據該模型自動預測整體動物切片中每個像素的RCF值(RCFpredicted)，并根據公式Intensitycal = Intensity /RCFpredicted獲得校正后的藥物響應強度（Intensitycal）。將校正響應值用于構建標準曲線，其線性相關系數從未校正的0.45增至校正后的0.99（圖1C）。 使用校正后的標準曲線確定整體動物體內的藥物絕對含量。此外，該方法利用豐富的內源性代謝物質譜信息，通過機器學習可自動識別動物體內的生理分區（圖1D）；它可替代需在光學或H&E染色指導下的人工分區方法。綜上，VC-QMSI可用于復雜的整體動物樣本中藥物的空間分辨定量分析（圖1E）。
圖1 VC-QMSI策略在整體動物組織中準確定位抗腫瘤藥物的過程示意圖 （A）基于內源性代謝物的機器學習方法預測相對校正因子的示意圖 （B）不同器官的相對校正因子成像以及相對校正因子預測值和實測值的比較；縮寫：H心臟，Li肝臟，Sp脾，Lu肺，K腎，Br大腦，M肌肉，Tu腫瘤 （C）以藥物含量-未校正的藥物響應強度構成的標準曲線和以藥物含量-校正后的藥物響應強度構成的虛擬校正標準曲線對比 （D）通過使用K均值和t-SNE聚類分析進行自動像素標記的整體動物分割圖像 （E）整體動物體內藥物定量的可視化結果以及光學圖像
PTX組和PTX-liposome組：PTX在動物體內呈廣泛分布，在心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腸、胃和腫瘤組織中均有分布；在健康組織中的含量遠高于PTX-R組；給藥后期可觀察到PTX在胃腸道中大量積累，而在腎組織中幾乎不見，提示PTX可能主要通過膽汁-糞便途徑排泄。PTX-R組：與前兩組的廣泛分布不同，PTX-R主要分布于腫瘤組織，其次是肺和腸。三組小鼠腦中均沒有明顯的藥物分布。就24h內的腫瘤組織藥物暴露量而言，PTX-R組與PTX-liposome組相當，是PTX組的2倍；以PTX組為參比，PTX-R組的相對靶向效率（RTE）是PTX-liposome組的近50倍。以上證明PTX-R有良好的腫瘤靶向能力。
圖2 三個給藥組在不同時間點的AFADESI-MSI可視圖（A）PTX在整體動物體內的時空和定量分布（B）PTX在腫瘤組織中的時空和定量分布
腫瘤根據形態學的異質性可分為不同的微區（圖A，B）。基于代謝物特征采用t-SNE和k-means等手段得到的腫瘤微區自動識別的結果（圖C）與H＆E染色結果（圖A）高度一致。PTX-R在腫瘤壞死區域和膠原蛋白區域的含量明顯高于腫瘤薄壁組織區域（圖D，E, F），表明PTX-R具有出色的腫瘤穿透能力。對比腫瘤的薄壁組織和間質區域，PTX-R更多地積累于腫瘤中未明顯分化的區域，比如腫瘤的膠原蛋白區域和脂肪組織。這種藥物在腫瘤微區分布的異質性值得進一步研究，它對于認識腫瘤的生長、侵襲、對藥物的敏感性以及預后均有重要作用。
圖3 PTX-R在瘤內的異質分布（A）腫瘤組織的H＆E染色圖像（B）放大倍數（×20）的代表性腫瘤微區（C）基于代謝物譜的腫瘤微區的t-SNE空間分布（D）PTX-R在腫瘤微區中的分布（E）藥物離子成像和H＆E染色成像之間的耦合匹配疊加圖（F）腫瘤微區中PTX-R的定量分布
采用無需標記的AFADESI和VC-QMSI技術成功建立了針對紫杉醇及其前藥的定量質譜成像方法，評估了該類抗腫瘤藥物的腫瘤靶向效率和瘤內分布異質性，并提供了直觀的實驗證據表明設計的紫杉醇前藥具備優異的腫瘤蓄積能力和低全身毒性。進一步證明AFADESI-MSI技術具有高靈敏和寬覆蓋的特點，可在整體動物的體內微區同時可視化各種類型的藥物、代謝物和內源性代謝物。VC-QMSI方法將內源性代謝物作為內標，建立ANN模型；根據模型預測每個像素的RCF值，并校正藥物離子強度，從而實現藥物在整體動物和亞器官組織中的定量可視化。紫杉醇前藥及其代謝物的體內定量分布研究有助于從藥物的保留、消除、靶向和釋放四個角度設計有效的腫瘤靶向藥物。所建方法有助于預測與藥物分布相關的藥效和安全性，在抗腫瘤藥物研發早期進行直接快速的藥效篩查，減少損耗、降低成本。此外，本研究對闡明藥物的功效、毒性和耐藥性提供了一個深入的視角，有助于抗腫瘤藥物的設計和優化。
數據來源：“質譜成像”微信公眾號
